PCR实验室/新冠检测实验室核酸气溶胶污染终极解决方案
随着非洲猪瘟及新冠疫情的出现，分子诊断（荧光PCR）技术在农业畜牧行业、公共健康领域得到了快速的普及。尤其是在农业畜牧领域，部分实验室仓促上马，基础硬件不是十分完善，在实际运行中，经常会碰到PCR检测结果假阳性的问题。之所以出现假阳性，其本质是样本被外源性阳性核酸（质粒或者靶标核酸气溶胶）污染所致。
下面就PCR实验室出现假阳性（核酸污染）的具体原因及应对措施分析如下：
一、核酸气溶胶污染的直接因素：
二、核酸气溶胶污染的间接原因：
1. 不合理的实验室建设
严格的PCR实验室应有标准的正负压系统及四分区，实验室应按照生物安全二级实验室及PCR实验室设计基本要求来建设。可参考的标准为《GB50346-2011建设标准生物安全实验室建筑技术规范》及卫健委下发的《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》。标准实验室如下图：
标准化PCR实验室（图片源于网络，侵删）
1.1 试验分区不能少于2个：标准化实验室含有四个分区：试剂准备区、样本处理区、扩增区、产物分析区；四分区是基于普通PCR和荧光PCR同时开展的试验而设计的；对于大多数尤其是基层非瘟检测实验室、新冠PCR检测实验室，主要以荧光PCR技术为主，避免了开盖及开放式的扩增操作，并不会涉及到电泳PCR,因此扩增区和产物分析区可以合并为一个分区；基层PCR实验室可以设置3个分区；但是不能低于2个，如果只有1个分区，即配置、分装、检测均在一个房间，依据笔者经验，只要运行超过一周的，必定会造成实验室环境核酸污染，假阳性率高！
1.2 正负压系统：农业领域基层PCR实验室很少装有正负压系统，这就要求我们不同试验区域要保持良好的通风（尤其是扩增区域），且通风口不能朝向对侧试验区域。
1.3 生物安全柜：购买二级生物安全柜应选择B2型生物安全柜；A1型、A2型、B1型为70%气体通过HEPA过滤器再循环至工作区；B2型为100%全排放型，无内部循环气流。因此只有B2型可以用于加样（阳性对照）。因为HEPA过滤器并不能有效过滤气溶胶质粒。生物安全柜配置错误，在加样的时候，循环风很容易造成核酸气溶胶的形成，从而造成污染，且污染很难清除。如果是非B2型，建议加样时，直接关闭通风系统；加样后，开紫外照射30分钟。
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分级 |
工作进风速度（m/s） |
循环风比例（%） |
排风比例（%） |
与排风系统的连接方式 |
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Ⅰ级 [1] |
0.36 |
0 |
100 |
密闭连接 |
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Ⅱ级 |
A1 |
0.38～0.51 |
70 |
30 |
可排到房间或设置排风罩 |
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A2 |
0.51 |
70 |
30 |
可排到房间或设置排风罩 |
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B1 |
0.51 |
30 |
70 |
密闭连接 |
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B2 |
0.51 |
0 |
100 |
密闭连接 |
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Ⅲ级 |
0.51 |
0 |
100 |
密闭连接 |
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不同型号的生物安全柜区别
1.4 紫外灯没有配置：紫外灯除了能杀灭病毒外，针对核酸也能起到降解的作用。一方面,紫外线直接作用于核酸或者气溶胶质粒，造成核酸氢键断裂，从而裂解核酸；但是《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》指出，短片段的目的基因核酸对紫外线损伤不敏感。常规消毒剂如酒精、碘化物、戊二醛类、季铵盐等虽然能杀菌，但是不能降解核酸，或降解效率较差。已知的消毒剂中，次氯酸盐类消毒剂可以一定程度的降解核酸，但是腐蚀性强，不能处理精密仪器及金属制品。
2. 管理制度不完善：
没有做到人流、物流单向流动；不同试验区域的物品、耗材、器械、实验服混用！试验人员配置低于2名，管理混乱，造成核酸污染！
完善的制度能保证实验持久长期的稳定运行，笔者依据临床经验，凡是实验室物品混匀，试验人员没有分工，只要超过运行15天，实验室出现污染的风险概率达到90%！应至少保证不同区域的物品传递应通过传递窗，人员应保证2名，一名专职配液分装，另一名可以处理样品，上机分析！这是保障基层实验室运行的最低要求。
3. 那些容易忽视的操作细节：
3.1 处理样品时，没有注意清理手套接触的阳性血污或其他样本，造成其他样本污染。从而造成假阳性；
3.2 处理样本时，忘记更换tip枪头，造成样本交叉污染；
3.3 吸取阳性对照（质粒）没有遵循“慢吸快打”的原则，造成阳性对照污染枪头，或者在生物安全柜循环风的影响下，造成气溶胶飞溅，污染加样区域。最好使用带有滤芯的枪头。
带滤芯枪头
3.4 加样区没有放置桌面垃圾桶：加完样品的tip枪可能含有高浓度的阳性核酸靶标，如果乱丢弃，可能造成气溶胶污染；应把tip枪头丢入含有次氯酸溶液的桌面垃圾桶中。每天都要更换含氯消毒液！
桌面垃圾桶
3.5 上机扩增后八连管开盖：扩增产物开盖是一定要禁忌的！虽然现在荧光PCR试剂盒大都通过UNG酶技术来预防扩增产物的污染，但是扩增产物开盖，仍是污染的重要来源。扩增后的八连管，应及时放到含有次氯酸盐的废液桶里浸泡。次氯酸盐发挥作用的是溶于水后产生具有氧化性的次氯酸，有挥发性，因此要定期（2~3天）更换浸泡液或者重加加入次氯酸盐，保证次氯酸含量不低于10%。
4. 那些容易忽视的污染高风险区域：
在笔者的临床实践中，发现以下区域存在阳性污染：
笔者在某实验室发生污染时，在不同区域采集10个样本，通过PCR扩增分析后，比较不同区域的阳性检出率。发现样品处理区的核酸提取仪与离心机污染的程度最高（8/10），其次是传递窗（7/10）。在临床实践中，移液器也是污染的高风险项。不同实验室的污染情况都是不一样的，就像这个世界上，幸福的家庭都一样，不幸的家庭倒是各有各的不幸。同理，规范的实验室都一样，污染的实验室各有各的污染情况。以上数据仅供参考。
三、PCR污染的监测
在日常实验室运行中，要时刻注意监测实验室的污染情况。了解实验室有无污染，污染原因，污染程度，以便采取有效措施，防止和消除污染。一般通过设置阴性质控品来监测污染情况。
3.1 试验过程监测：
目前，多数试剂盒的阴性对照是在配置PCR反应液，上机扩增这一环节进行质控。没有对核酸提取进行质控。因此，每次开展试验应增加3个纯化水样品，分布于待检样品的前、中、后位次，参与核酸提取，扩增，保证实验从样品处理、核酸提取、扩增3个步骤的全过程的阴性监控。防止整个试验过程可能存在的阳性污染。
3.2 日常实验室环境检测：
监控对象：实验室内的仪器设备、空气、物体表面：
环境监测：每个实验区放置10ml单蒸水水（敞口），1个小时后，取样200μl。作为样品，参与提取、扩增，分析实验室环境是否存在气溶胶污染。
物体表面监测：物体表面擦拭取样：用棉拭子蘸取生理盐水，在实验室台面（尤其是四周死角）、仪器表面和内孔涂抹取样后放入约0.5mL生理盐水中取样。作为样品，参与提取、扩增，分析物体表面是否存在气溶胶污染。
四、解决PCR实验室污染的方法
4.1 “人、机、料、法、环”：首先针对上述产生气溶胶污染的原因进行分析，从人员、硬件配置、物料、方法（SOP）、环境五个方面进行认真复盘，整改。这是保证实验室长治久安、不发生污染的基本前提。
（图片源于网络，侵删）
4.2 选用含有UNG酶防止污染设计的荧光PCR检测试剂盒。该技术可以降低实验室被扩增产物的污染，从而将风险降低至少70%。但是仍有30%的污染风险是由于阳性对照质粒气溶胶产生。UNG酶无法降解阳性质粒，还是要从管理角度解决问题。
4.3 发生污染时的处理：
发生污染处理措施根据污染的区域来源：空气中的气溶胶污染和吸附到仪器设备上的核酸污染物：
4.3.1 吸附在仪器设备耗材表面上的核酸污染处理：
（1）更换污染区的耗材（主要是吸头和离心管）、实验服应用次氯酸盐溶液浸泡1小时后，进行洗涤处理；
（2）可以选用没有腐蚀性，对试验人员及环境友好，无刺激的核酸清除剂，例如纳克生物的“PCR核酸质粒气溶胶污染清除剂”（可淘宝搜索购买）。主要原理是通过酶解作用，清除效果较强，比常见的强氧化剂（次氯酸盐）降解效果要好！该试剂可以处理怕腐蚀的区域如：移液器、生物安全柜、离心机、传递窗等区域进行喷洒清除。
核酸清除剂（酵母酶）
（3）用次氯酸盐如84消毒剂（具有腐蚀性，不能用于金属制品）喷洒试验桌面、地面、墙面，20分钟后，用一次性吸水纸或者干净抹布擦拭干净。有效氯含量应不低于6g/L;
不同有效氯浓度下核酸清除效果
数据图片来自“原博士带你做检测”公众号
（4）打开实验室所有紫外灯（生物安全柜、传递窗、实验室等），18h后，打开通风系统，即可解除污染。
（5）注意：试验耗材、工作衣等进行121℃30分钟高压，虽然有一定的作用，并不能完全去除质粒核酸的污染。
4.3.2 空气中的核酸气溶胶污染处理：
可以通过长时间的紫外线照射，至少18个小时以上，无法降解200bp以下的短片段核酸，效果非常有限，并且容易产生处理死角。也可以通过纳克生物研发的“核酸气溶胶污染清除仪”对空气中的气溶胶进行清除！清除效率高，最快可2小时解决空气中的气溶胶污染问题！“她”更大的价值是，每天实验结束，打开仪器60分钟，能大大降低实验室的污染概率。毕竟，核酸气溶胶的污染，用于是预防大于治理！“不污染”才是最好的治理！
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